Sylabus:

1. Úvod do genomiky. Základy bioinformatiky – definice pojmů, zdroje dat. Teorie základních bioinformatických nástrojů. Definice a struktura genů, in silico a a experimentální identifikace genů, určení sekvence nukleových kyselin (Sanger, NGS). Genetika přímá vs. reverzní – rozdíly v myšlenkových a experimentálních přístupech. Genová exprese a fenotypové profilování – metody kvalitativní i kvantitativní analýzy genové exprese (in vitro a in vivo lokalizace mRNA a proteinů; transkripční vs. translační fúze; DNA čipy a next-gene profilování), tkáňově a buněčně specifická analýza genové exprese na genomové úrovni.
2. Úvod do proteomiky. Definice pojmů protein, proteoforma, proteom, proteotyp. Proteinové databáze, vyhledání a určení základních vlastností proteinů in silico a pomocí experimentálních přístupů. Analýza proteinů pomocí hmotností spektrometrie (MS) – principy a možnosti v biochemii. Vysokoprostupná analýza proteinů a proteomů, principy necílené a cílené kvantifikace. Funkční proteomika, analýza interakcí protein-protein a proteinových komplexů, klasifikace proteinových vzorků pomocí MS. Návrh experimentu, analýza dat, interpretace a validace. Imunochemické přístupy a jejich komplementarita. Strukturní přístupy na bázi MS.
3. Příprava rekombinantních proteinů. Definice, historie. Expresní systémy, vektory, značky. Amplifikace genu, klonování, selekce buněk s klonovaným genem, indukce exprese. Místně cílená mutageneze.
4. Extrakce, purifikace a kvantifikace proteinů. Lýze buněk, inhibice proteolýzy a oxidace, solubilizace inkluzních tělísek. Nechromatografické metody – frakcionace, ultrafiltrace, diferenciální centrifugace, preparativní elektroforéza a izoelektrická fokusace. Chromatografické metody – gelová permeační, iontově výměnná, chromatofokusace, hydrofobní, afinitní, kovalentní. Metody stanovení celkového proteinu. Kritéria čistoty proteinu.
5. Stavba proteinů. Sekundární struktury, motivy terciárních struktur, kvartérní struktura, intra- a intermolekulární interakce stabilizující proteinové struktury (hydrofobní efekt, iontové interakce, vodíkové vazby, disulfidové vazby).
6. Určení prostorové struktury biopolymerů. CD a IR spektrometrie, NMR, rentgenostrukturní analýza, elektronová mikroskopie, 3D-MS. Homologní modelování na základě známých struktur.
7. Kinetika a energetika enzymové reakce. Experimentální stanovení kinetických parametrů ve stacionárním a prestacionárním stavu. Interpretace v rámci teorie aktivovaného komplexu. Kvantitativní vyjádření „dokonalosti“ enzymové katalýzy a selektivity enzymového působení.
8. Inhibitory enzymů v praxi. Klasifikace inhibitorů, stanovení inhibičních konstant. Příklady inhibitorů a mechanismu jejich účinku: léčiva, herbicidy, toxiny.
9. Bioenergetika. Chemiosmotický mechanismus konzervace energie. Principy organizace elektrontransportních řetězců u mitochondrií, chloroplastů a bakterií. Zapojení mitochondrií a chloroplastů do buněčného metabolismu.
10. Molekulové motory. Bakteriální bičíky, rotační katalýza v ATP synthase, kinesiny, dyneiny, myosiny, cytoskeletální transport, činnost svalů, řasinek a bičíků
11. Mezibuněčná a vnitrobuněčná signalizace. Signály intrakrinní, autokrinní, juxtakrinní, parakrinní a endokrinní. Hormony (eikosanoidy, steroidy, deriváty aminokyselin). Receptory spojené s iontovými kanály, G-proteiny a tyrosinkinasou; intracelulární receptory. Druzí poslové a jejich funkce – cAMP, cGMP, inositoltrisfosfát, Ca2+, NO, diacylglycerol, fosfoinositidy. Příklady signálních drah.
12. Integrace a regulace energetického metabolismu u člověka. Energetické zásoby. Zdroje ATP (ADP/adenylátkinasa, fosfokreatin/kreatinkinasa, anaerobní a aerobní metabolismus), působení hormonů, kontrolní místa regulace metabolismu sacharidů a lipidů, funkce AMP-dependentní proteinkinasy, orgánová specifita.

Doporučená literatura:

• Textbook of Structural Biology, A. Liljas, L. Liljas, J. Piskur, G. Lindblom, P. Nissen, M. Kjeldgaard: World Scientific Publishing Co., Singapore, 2009
• Protein-protein interactions. Edited by E.A. Golemis and P.D. Adams. 2nd ed. Cold Spring Harbor, New York, N.Y.: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2005
• Uetz P. and Finley RL Jr.: From protein networks to biological systems, FEBS Lett. 2005, 21;579(8):1821-7.
• Analytical chemistry. Christian, G. D., 6th ed. Hoboken, NJ : John Wiley & Sons, 2003
• Trace quantitative analysis by Mass spectrometry, Boyd et al., Willey 2008
• Bioanalytical chemistry, Mikkelsen, Susan R, Cortón, Eduardo. Hoboken, N.J., John Wiley & Sons, 2004
• Analytické separační metody, Štulík, Karel. 1. vyd. Praha, Karolinum, 2004

Spektroskopické metody

1. Informace o trojrozměrné struktuře nepocházející z interakce se záření Chemické síťování (cross-linking) s detekcí hmotnostní spektrometrií, mikroskopie atomárních sil (AFM).
2. Využití optické spektroskopie (v ultrafialové, viditelné, infračervené oblasti) ve strukturní biologii, absorpce, fluorescence. Určování sekundární struktury biomakromolekul, použití cirkulárního dichroismu.
3. Základní principy NMR. Magnetický dipólový moment jader, jeho precese v homogenním externím magnetickém poli, distribuce orientací magnetických momentů a magnetizace v termodynamické rovnováze, koncept koherence, základní NMR experiment, NMR spektrometr, využití radiových vln, detekce signá
4. Lokální magnetická pole v molekule (vliv elektronů a ostatních jader), jejich vliv na precesi magnetických momentů jader a vývoj koherence, chemický posun, modulace nosné frekvence, Fourierova transformace, frekvenční
5. Heteronukleární NMR spektroskopie. Spinová echa, INEPT, HSQC, princip vícerozměrné
6. 3D NMR experimenty pro sekvenční přiřazení frekvencí proteinů. HNCA, HN(CO)CA, HNCACB, CBCA(CO)NH, princip sekvenčního přiřazení.
7. Principy homonukleární 2D NMR spektroskopie, NOESY experiment jako pří Isotropní směšování, TOCSY. Isotopově editované homonukleární experimenty, řiřazení postranních řetězců pomocí TOCSY-HSQC.
8. Získávání strukturních parametrů z NMR dat: měření vzdáleností vodíkových atomů, určování dihedrálních úhlů, zbytkové dipólové interakce v částečně orientovaných mediích, rekonstrukce prostorové struktury makromolekul, vázaná molekulová dynamika pro výpočet struktury.
9. NMR spektroskopie nukleových kyselin. Korelace v bazích a v cukrfosfátové páteři, sekvenční přiřazení, metody založené na NOE a heteronukleární
10. Molekulové pohyby a NMR relaxace, časové škály, interakce způsobující relaxaci, korelační funkce, funkce spektrální hustoty, vztah funkce spektrální hustoty a relaxační rychlosti, vliv pomalé výměny na relaxační rychlosti a na tvar čá

Difrakční metody

1. Rozptyl elektromagnetického záření na makromolekulách, anizotropie, hydrodynamický polomě Dynamický rozptyl světla (DLS, dynamic light scattering), monodisperzita, polydisperzita. Rozptyl rentgenového záření (SAXS).
2. Krystalizace proteinů, termodynamický (entalpie, entropie) a kinetický pohled (nukleace a růst krystalu) na krystalizaci, popis fázoveho diagramu krystalizace. Symetrie molekul a krystalů, operace symetrie, bodové Popis základních krystalografických buněk (translace, centrosymetrie).
3. Teorie difrakce, rozptyl rentgenového záření (elektrony, atomy, elementární buňkou, krystalem), difrakční podmí
4. Fourierova transformace, rozptylový faktor, strukturní faktor, symetrie difrakčních dat, zpracování difrakčních snímků, indexace difrakčních skvrn, integrace signál
5. ázový problém v rentgenové Isomorfní nahrazení (Isomorphous Replacement), využití anomálního rozptylu (SAD, MAD) a molekulové přemístění (Molecular Replacement), rotační a translační funkce.
6. Struktura elektronového mikroskopu a teorie elektronové Interakce elektronu s hmotou, slabý fázový object -- zdroje kontrastu v elektronové mikroskopii, filtrování obrazu. Contrast Transfer Function.
7. Fourierova transformace a jeji základní vlastnosti, konvoluce, korelace, rozptylová funkce (point spread function) při zobrazování v transmisním elektronovém mikroskopu.
8. Analýza snímků makromolekul z transmisního elektronového mikroskopu - klasifikace 2D obrazů. Principal component analysis. 3D klasifikace.
9. Výpočet struktur makromolekul z~dat získaných pomocí transmisní elektronové Metody 3D rekonstrukce: single particle reconstruction a tomografie.
10. Tvorba a zpřesňování modelů makromolekul postavených na základě krystalových map elektronové hustoty, nebo cryo-EM rekonstrukcí, (refinement), R-faktory, Ramachandranův diagram, validace a odhalení chyb, určení chyby souřadnic finálního modelu.